高效液相色譜儀（HPLC）方法介紹

分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數，離子交換色譜法為選擇性系數?。ɑ蚍Q交換系數），凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。

在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很?。r，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。

在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配系數相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數不同是色譜分離的前提。

在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。

（high performance liquid chromatography,HPLC）也叫高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography）、高速液相色譜（high speed liquid chromatography）、高分離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等或Efficient liquid chromatographyspectrometry。是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。

高效液相色譜是目前應用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn)；進樣系統要求進樣便利切換嚴密；由于液體流動相粘度遠遠高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠小于氣相色譜柱。HPLC應用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領域。

使用高效液相色譜時，液體待檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由于被測物種不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，最后通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應用于化學和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適于分析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。

1960年代，由于氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質，氣相色譜的理論和方法被重新引入經典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。

1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現代實踐》一書，標志著高效液相色譜法 (HPLC）正式建立。在此后的時間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫(yī)學、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、數據處理技術以及色譜理論的發(fā)展。

1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面臨著困境，后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸。

高壓——壓力可達150～300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。

高速——流速為0.1～10.0 mL/min。

高效——塔板數可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。

HPLC與經典液相色譜相比有以下優(yōu)點：

速度快——通常分析一個樣品在15～30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。

分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。

靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。

色譜柱可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

1.1分離原理 液固色譜是基于各組分吸附能力的差異進行混合物分離的，其固定相是固體吸附劑。

1.2固定相 ；吸附色譜固定相可以分為極性和非極性兩大類。

1.3流動相 ；流動相要求：

1.3.1選用的溶劑應當與固定相互不相溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性

1.3.2選用的溶劑應有高純度，以防所含微量雜質在柱中積累，引起柱性能的改變。

1.3.3選用的溶劑性能應與所使用的檢測器相匹配，如果使用紫外吸收檢測器，就不能選用在檢測波長下有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測器，就不能用梯度洗脫。

1.3.4選用的溶劑應對樣品有足夠的溶解能力，以提高測定的靈敏度。

1.3.5選用的溶劑應具有低的黏度和適當低的沸點。

1.3.6應盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保證工作人員的安全

1.4應用 液固色譜是以表面吸附性能力為依據的，所以它常用于分離極性不同低的化合物，也能分離那些具有相同極性基團，但數量不同的樣品。

1.1分離原理 ；分配色譜法的原理與液液萃取相同，都是分配定律。

1.2固定相 ；分配色譜固定相由兩部分組成，一部分是惰性載體，另一部分是涂漬在惰性載體上的固定液。

1.3流動相 ；分內色譜中，要求流動相盡可能不與固定液互溶

1.4應用 ；既能分離極性化合物，又能分離非極性化合物。由于不同極性鍵合固定相的出現，分離的選擇性可得到很好的控制。

1.1分離原理 1.1.1正鍵合相色譜分離遠離：使用的是極性鍵和固定性，溶質在此類固定相上的分離機理屬于分配色譜。

1.1.2反鍵合相色譜分離原理：使用的是極性較小的鍵合固定相，其分離機理可用疏溶劑作用理論來解釋。

1.2固定相 ；按極性大小可分為非極性、弱極性、極性化學鍵合固定相三種。

1.3流動相 1.3.1正鍵合相色譜中，采用和反相液液分配色譜相似的流動相，流動相的主體成分為己烷或庚烷。

1.3.2反相鍵合相色譜中，流動相采用和反相液液分配色譜相似的流動相，主題為水。

1.4應用 1.4.1正鍵合相色譜法的應用：多用于分離各類極性化合物如染料、炸藥、多巴胺、氨基酸等；

1.4.2反鍵合相色譜法的應用：由于操作簡單，穩(wěn)定性和重復性好，該方法已成為一種通用型液相色譜分析方法。在生物化學、醫(yī)藥研究、食品分析和環(huán)境污染分析等多個領域有了很大的應用和發(fā)展。

凝膠色譜又稱分子排阻色譜，它是按照分子尺寸大小順序進行分離的一種色譜方法。凝膠色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合材料，有一定的形狀和穩(wěn)定性。根據所用流動相的不同，凝膠色譜法可以分為兩類：即用水溶劑做流動相的凝膠過濾色譜法（GFC）與用有機溶劑如四氫呋喃做流動相的凝膠滲透色譜法（GPC）。

高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質。

與試樣預處理技術相配合，HPLC 所達到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時測定性質上十分相近的物質成為可能，能夠分離復雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離。

HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復利用，流出組分易收集等優(yōu)點，因而被廣泛應用到生物化學、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機分析等各種領域。高效液相色譜儀與結構儀器的聯用是一個重要的發(fā)展方向。

液相色譜- 質譜聯用技術受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農藥和多核芳烴等； 液相色譜- 紅外光譜聯用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測定水中的烴類，海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。

《高效液相色譜儀》（GB/T 26792-2011）《High performance liquid chromatography》于2011年12月1日實施。